摘要：綜述了RAPD技術(shù)的一些理論性問題，包括RAPD與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)，影響結(jié)果重復(fù)性的因素，顯性標(biāo)記產(chǎn)生的原因，條帶取舍的標(biāo)準(zhǔn)等。提出在實驗中解決這些問題的一些方法：嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，采用單倍體和單劑量標(biāo)記，系統(tǒng)學(xué)研究中要結(jié)合其它方法進(jìn)行分析，定位基因時要選用合適的群體等。
1.RAPD技術(shù)原理及特點(diǎn)
1．1原理RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA），即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，是由美國科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的，又稱任意引物PCR。它的應(yīng)用是基于這樣的一個推理：對于同一模板DNA，用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實上，不同基因組DNA總是一定差異的，所以用RAPD就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講，在一定的擴(kuò)增條件下，擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物，復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。
90年代前期RAPD技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，幾乎所有的作物都有這方面的研究報告。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷，并對此作了一些探索。本文僅就RAPD技術(shù)的原理和應(yīng)用中存在的理論性問題及一些改進(jìn)措施的研究作一綜述。
1.2RPAD特點(diǎn)與PCR相比，具有以下幾個特點(diǎn)：
與RFLP相比，具有以下特點(diǎn)：
①RAPD分析只需要少量模板，一次擴(kuò)增僅需20－100ng，這對于DNA量很少的材料進(jìn)行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質(zhì)體、種子等的DNA分析是切實可行的。
②RAPD標(biāo)記具有更大的隨機(jī)性，亦有利于圖譜的構(gòu)建。對于DNA含量大的和多倍體物種，RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交，所得到的混合指紋會對其它等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大，進(jìn)行單拷貝的southern雜交不很實際，至少需要很長的曝光時間，并且已知的探針數(shù)量有限。RAPD大大增加了可構(gòu)建遺傳圖譜物種的數(shù)量。
③無需借助于有傷害性的同位素，耗費(fèi)的人力物力少。
④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴(kuò)增條帶和強(qiáng)度的劇烈變化，這是RFLP所*的。
⑤RAPD標(biāo)記可以覆蓋整個基因組，包括編碼和非編碼區(qū)，可以反映整個基因組的變化。
⑥RAPD產(chǎn)物有大于50％的條帶擴(kuò)增于單拷貝區(qū)，經(jīng)過克隆和序列分析后，可作為RFLP和原位雜交的探針，在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應(yīng)用。
2.RAPD技術(shù)本身存在的問題及對策
RAPD技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng)，反應(yīng)中各種成分均為微量，盡管其反應(yīng)靈敏度高，但是影響因素較多，會出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問題。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果，各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇，操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎，以防止出現(xiàn)差錯。
2．1溫度RAPD一般反應(yīng)條件是：變性92－95℃，常用94℃，30－60s；延伸72℃，60－120s；退火35－37℃，30－60s。變性和延伸溫度一般沒有太大變化，而退火溫度影響較大。退火溫度低，引物和模板結(jié)合特異性較差，出現(xiàn)的條帶可能增多；退火溫度高，引物和模板結(jié)合特異性增加。有人提出，在尋找基因差異為目的的實驗中，退火采用33－34℃效果更好。在優(yōu)化方案中，退火溫度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂帶＂。溫度的梯度率也是十分重要的，特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別，一些儀器（如一些舊型號的儀器）在到達(dá)特定的溫度前就開始計時，一些PCR儀顯示的溫度與實際溫度會有差異。這些在設(shè)計程序和結(jié)果分析時有必要考慮，所以注明所用儀器的生產(chǎn)廠家、品牌、規(guī)格，就顯得很有必要，對于同一批實驗，注意控制在同樣的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果才有可比性。
