一、CaCl₂ 感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟

．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH0B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜（約6小時(shí)）；

2．取 ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于00ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)（250-300rpm）；

3．將 0.M CaCl₂ 溶液置于冰上預(yù)冷；

以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作

4．吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中，在冰上冷卻0分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 00μl預(yù)冷0.M CaCl₂ 溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

8．棄去上清，加入 00μl預(yù)冷0.M CaCl₂ 溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；

9．細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（ 5% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。

二、電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟

．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH0B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；

2．取 2ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.6（約2.5-3小時(shí)）；

3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作

4．吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中，在冰上冷卻0分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 500μl冰冷的0%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

8．棄去上清，加入 750μl冰冷的0%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；

9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

0．加入 20μl冰冷0%的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；

．立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。

附注：

影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：

．細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生的細(xì)胞（一般通過(guò)檢測(cè)OD600 來(lái)控制。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時(shí)細(xì)胞密度是 5 × 0⁷ /ml ）；

2．所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行；

3．經(jīng) CaCl₂ 處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加， 24小時(shí)達(dá)到zui高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；

4．化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在 Ca ²⁺ 的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如 Mn ²⁺ 或 Co ²⁺ ）、 DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 00-000 倍）；

5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；

6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA ；

7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比。

詳情請(qǐng)看：感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)