一、CaCl₂ 感受態(tài)細胞的制備的實驗步驟

．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH0B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約6小時）；

2．取 ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于00ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；

3．將 0.M CaCl₂ 溶液置于冰上預冷；

以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

4．吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中，在冰上冷卻0分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 00μl預冷0.M CaCl₂ 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

8．棄去上清，加入 00μl預冷0.M CaCl₂ 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?/p>

9．細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑（ 5% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。

二、電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟

．前夜接種受體菌（ DH5α或 DH0B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜；

2．取 2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.6（約2.5-3小時）；

3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作

4．吸取 .5ml培養(yǎng)好的菌液至.5ml離心管中，在冰上冷卻0分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入 500μl冰冷的0%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?/p>

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

8．棄去上清，加入 750μl冰冷的0%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

0．加入 20μl冰冷0%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；

．立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。

附注：

影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項：

．細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生的細胞（一般通過檢測OD600 來控制。DH5α菌株 OD600 為 0.5 時細胞密度是 5 × 0⁷ /ml ）；

2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行；

3．經(jīng) CaCl₂ 處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加， 24小時達到zui高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）；

4．化合物及無機離子的影響：在 Ca ²⁺ 的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如 Mn ²⁺ 或 Co ²⁺ ）、 DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 00-000 倍）；

5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率；

6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應主要是超螺旋的 DNA ；

7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比。

詳情請看：感受態(tài)細胞制備實驗