蛋白質(zhì)的定量分析主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來(lái)進(jìn)行的。目前常用的蛋白質(zhì)的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。
實(shí)驗(yàn)原理：BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法測(cè)定蛋白的原理 二價(jià)銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子(biuret reaction)，一價(jià)銅離子和du特的BCA溶液A(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并于標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。
實(shí)驗(yàn)材料：
1.試劑A 含1%BCA二鈉鹽溶液、2% 無(wú)水Na2CO3溶液、0.16%酒石酸鈉溶液、0.4%氫氧化鈉溶液、0.95% NaHCO?溶液，將上述液體混勻后調(diào)PH至11.25。
2.試劑B 4%硫酸銅溶液。
3.BCA工作液 按50體積試劑A加1體積試劑B(50：1)，配制適量BCA工作液，充分混勻。
4.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液
(1)儲(chǔ)存液配制：準(zhǔn)確稱取50mg牛血清白蛋白，溶于10ml蒸餾水或PBS中，即為5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存液。
(2)工作液：取儲(chǔ)存液10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml。
實(shí)驗(yàn)儀器：
主要儀器酶標(biāo)儀是分光光度計(jì)的另一種形式；光電檢測(cè)器將待測(cè)標(biāo)本不同而強(qiáng)弱不同的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，電信號(hào)經(jīng)前置放大、對(duì)數(shù)放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號(hào)處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算。
實(shí)驗(yàn)方法：
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照標(biāo)準(zhǔn)配制蛋白質(zhì)溶液及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。
2、各孔加入200ul BCA 工作液，37℃培養(yǎng)箱放置15~30min。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。
