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熒光定量PCR實驗步驟:
①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。
產品名稱:副雞禽桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱:Avibacterium paragallinarum
貨號:XG01P3289
分類:熒光定量PCR試劑盒
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
實時定量PCR:
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
②反應體系如下:
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽性模板上游引物F 0.5μl
3 陽性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
基因反應體系:
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內參照上游引物F 0.5μl
3 內參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個循環(huán)。
PCR特異性:
1.primers design
這是重要的一步。理想的,只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件:
1)足夠長,18~24bp,以保證特異性,當然,不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產量;
2)GC%,40%~60%;
3)5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性;
4)避免3'端GCrich,個BASE不要有GC,或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補,否則,容易造成DIMER;
6)避免3'端的錯配;
7)避免內部形成二級結構;
8)附加序列(RT site,Promoter sequence)加到5'端,在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構要加上它們;
9)使用兼并primer時,要參考密碼子使用表,注意:生物偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用較高的primer濃度(1μM~3μM);
10)學會使用一種design software,PP5,Oligo6,DNA star,Vector NTI,Online design et al。
2-溴胺溴鹽98%Anti-FOXP1antibody[EPR4113]
2-二氨基氯烷鹽鹽99%Anti-FOXP1antibody[EPR4113]
5-氯水楊99%Anti-FOXP1antibody[EPR4113]
氯化AR,98%Anti-XRCC1antibody[EPR4389(2)]
氯化99%Anti-XRCC1antibody[EPR4389(2)]
二月桂二基錫95%Anti-XRCC1antibody[EPR4389(2)]
2-二氨基氯烷鹽鹽99%Anti-GATA4antibody[EPR4768]
二二酯99%Anti-GATA4antibody[EPR4768]
二氨基醇99%Anti-GATA4antibody[EPR4768]
2,3-二溴二98%Anti-CEACAM6antibody[EPR4404(2)]
二烯三胺五CPAnti-CEACAM6antibody[EPR4404(2)]
二烯三胺五AR,99.0%Anti-CEACAM6antibody[EPR4404(2)]
鹽二胺99%Anti-Laminingamma1antibody[EPR8217]
鹽二胺CP,98%Anti-Laminingamma1antibody[EPR8217]
鹽二胺AR,99%Anti-Laminingamma1antibody[EPR8217]
副雞禽桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒三十二烷standardforGC,≥98.0%(GC)Anti-S100A10antibody
三十二烷96%Anti-MMP3antibody
三十二烷分析標準品,≥99.0%(GC)Anti-Notch2antibody
二烷,含穩(wěn)定劑銅屑,98%Anti-GRK2antibody-C-terminal
二烷CP,95%Anti-TSHZ1antibody
N,N-二基對苯二胺鹽AR,98.0%Anti-ERp29antibody
N,N-二基酰胺StandardforGC,≥99.9%(GC)Anti-NFkBInducingKinaseNIKantibody-N-terminal
鉛試劑ARAnti-BetaTRCP/HOSantibody
鉛試劑高純級,99%Anti-Cdk4antibody
1,3-二氯烷standardforGC,≥99.5%(GC)Anti-KLF5antibody
二氨基基纖維素TLCAnti-CCN3antibody
二氨基基纖維素N-300TLCAnti-ornithineaminotransferaseantibody
二二醇StandardforGC,≥99.5%(GC)Anti-Hsp70antibody
N,N-二基對苯二胺二鹽鹽99%,用于過氧化物酶試驗Anti-Proteasome20SC2/HC2antibody
N,N-二基對苯二胺二鹽鹽AR,環(huán)保試劑,96%Anti-FCP1antibody
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