5min極速病毒RNA提取試劑盒

本試劑盒采用裂解液，可快速可靠的從病毒液樣本中純化出高純度的總 RNA。該試劑盒是目前國(guó)際上操作步驟最少、用時(shí)最短的病毒 RNA 提取試劑盒（僅需要 5 分鐘）。應(yīng)用本試劑盒提取的 RNA 可直接用于反轉(zhuǎn)錄、基因克隆、定量 PCR 檢測(cè)等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
(1) 本試劑盒中的 Washing Buffer 中已經(jīng)加乙醇，無(wú)需單獨(dú)添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蝕性，注意防護(hù)。
操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中處理）
液體樣本：血清、血漿、唾液、痰液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)病毒上清液等液體樣本直接吸取 150 μl 到 1.5ml EP 管中，并加入 120 μl RNALB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開(kāi) 1.5ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNABB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30秒，倒掉過(guò)柱后的廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
抗凝全血：直接吸取 150 μl 到 1.5 ml EP 管中，并加入 120 μl RNA
LB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開(kāi) 1.5 ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNA
BB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。13000 rpm 離心 30 秒后，將上清液倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30 秒，倒掉過(guò)柱后的廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
固體樣本：組織、糞便等樣本。取 10~100 mg 固體材料樣本，加入到 300 μl RNA LB1 中（1.5ml EP 管），并加入幾粒鋼珠（一般3~4 粒），置于組織研磨儀中，研磨 1 分鐘。研磨完畢后，打開(kāi)管
蓋，向勻漿液中加入 750 μl RNA BB2，并 13000 rpm 離心 1 分鐘。
打開(kāi)管蓋，用 1 ml 吸頭吸取 750 μl 上清液到吸附柱中。13000 rpm離心 30 秒，倒掉過(guò)柱廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
（2） 洗滌和洗脫
上述裂解/上柱操作完畢后，向吸附柱中加入 500 μl WashingBuffer，13000 rpm 離心 15 秒，并倒掉過(guò)柱廢液。重復(fù)此洗滌步驟一次。 將吸附柱重新放回離心機(jī)，13000 rpm 空離心 1min，將殘留的乙醇甩干。 將吸附柱芯放入到 1.5 mL Nuclease Free收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置1 min，13,000rpm離心 1min，洗脫液即為提取的病毒RNA，冷凍保存。
特別說(shuō)明：
（1）RNA LB1 和 RNA BB2 含有高鹽，在樣本加入到此溶液后，病毒會(huì)迅速滅活。同時(shí)此溶液對(duì)皮膚有腐蝕性，務(wù)必做好防護(hù)，如接觸到皮膚，用大量清水沖洗。
（2）樣本處理過(guò)程中的吸頭等材料可能含病毒分子，實(shí)驗(yàn)完畢后務(wù)必妥善處理，不能隨意丟棄。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。