LAMP Loop DP-Probe (訂制品)

該 DP-Probe(DisPlaceable Probe)為鏈置換熒光探針，專用于LAMP 的熒光擴增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 試劑時表現(xiàn)出極為出色的特異性，可以大幅降低非特異性擴增。LoopDP-Probe Pair 是將 Loop 引物進行改造（LF/B 任意一條均可），其由兩條標(biāo)記引物退火組成：熒光猝滅引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和熒光報告引物（Tail 互補區(qū)+3’發(fā)光基團），其不發(fā)熒光。在 LAMP反應(yīng)中 Loop 引物滲入到“啞鈴"結(jié)構(gòu)，由擴增返回“啞鈴"延伸并置換游離的熒光報告引物，累積產(chǎn)生熒光信號。有經(jīng)驗的研究人員可根據(jù)參考文獻自行制備 LAMP Loop DP-Probe Pair，經(jīng)驗不足的人員可委托  來制備， 提供三種熒光標(biāo)記的探針。需要客戶提供 Loop 序列，并指明需要的熒光標(biāo)記（FAM/JOE/ROX）

eLAMP DP-Probe 試劑的開發(fā)簡述
1. 引物的粗篩選
無論是變色、試紙條、熒光法 eLAMP 試劑的開發(fā)，前期的測試過程， 推薦采用價格較低的液體 HotStart Bst4.2 SYBR Green試劑（進行粗篩選。通常篩選的引物為 3-5 組。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.測試樣品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重復(fù))
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到總體積 25 μl置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號。

良好的引物組具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies<15min;10Copies<20min, ntc="">40min. 以上實驗需要反復(fù)確認(rèn)，以確
保核心引物的工作效率，否則重新篩選，再進行后續(xù)的其它測試。
2. Loop DP-Probe Pair 的制備
根據(jù)上述引物組的篩選情況，選取引物組。在此基礎(chǔ)上改造LF 或 LB，改造哪一條效果更佳，必須經(jīng)過測試。下面以改造 LF為例進行說明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制備）。

注意：

（1）測試試劑更改為 HotStart Bst4.2 Basic 試劑。

（2）10xeLAMP Mix 引物濃度有調(diào)整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號（注意根據(jù)探針熒光標(biāo)記，選取正確的熒光通道）。與 SYBR Green 結(jié)果相比來看，時間會滯后 1-3min。NTC 的控制會明顯提升。

此時可進一步做后續(xù)的其它項目測試。
3. 如有試劑凍干制備的需求可采用如下幾種方案：
（1）(液體試劑)+PrimerMix 自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（2）PrimerMix+(引物凍干劑)自行凍干，加入 (凍干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（4）委托  進行全體系凍干。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。