Bst 4.0凍干Buffer(含凍干賦形劑)

本品為 Bst3.0、4.0 DNA/RNA 聚合酶的專用凍干buffer 系統(tǒng)，為 2.5 倍濃度，包含了反應(yīng)緩沖鹽、Mg2+、凍干賦形劑，在配制體系時加入 dNTP、Bst4.0DNA/RNA 聚合酶后，直接進行凍干反應(yīng)。無需再進行凍干保護劑的條件優(yōu)化工作。

儲存：-20℃保存 2 年；短期使用放置于 2-8℃，保存 3個月。反復(fù)凍融 10 次，不影響使用。如有白色沉淀，于37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影響使用。該 Buffer中含有 15 mM Mg2+，必要時可自行調(diào)整。
注意：本試劑僅適用于  生產(chǎn)的無甘油系列 Bst 3.0、4.0.
使用方法：
1. 配制凍干體系
2.5xBst4.0 Lyo Buffer 10 μl10 mM each dNTP 2.5 μlBst4.0 Glycerol Free(32U/ul) 0.2-0.5 μl12.5xLAMP Primer Mix 2 μlddH2O到總體積 15 μl
注意：（1）該混合物 15 μl 加入到 0.2ml EP 管后上機凍干。該反應(yīng)體系設(shè)計為 25 μl 的終反應(yīng)體系，凍干體積為15 μl。
（2） 12.5xLAMP Primer Mix 的配制，F(xiàn)IP/BIP 分別為20 μM、LoopF/B 分別為 5 μM、F3/B3 分別為 2.5 μM。2. 反應(yīng)體系凍干完畢后凍干品中加入檢測模板和 ddH20（總體積25 μl）即可進行 LAMP 等恒溫擴增。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。