His標(biāo)簽純化樹脂（Ni-NTA Resin）

描述：

Ni-NTA Resin 是用于純化 6×His 標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由 4%交聯(lián)的 Sepharose 耦連了一種四齒螯合劑 NTA 而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的 6xHis 標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合 Ni2+。6×His 可與 Ni2+螯合，從而使 His 標(biāo)簽蛋白結(jié)合在 Ni-NTA 純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低 PH 緩沖液被溫和的洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。
主要特征
該純化介質(zhì)與 His 標(biāo)簽蛋白具有的親和力，可達5-20 mg/ml。
可在非變性和變性條件下純化任何表達系統(tǒng)所得的 His標(biāo)簽蛋白。
純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達 95％。
Ni-NTA 可再生 4-6 次，重復(fù)使用。
組成：50％的懸浮液（20％乙醇），已螯合 Ni2+。
應(yīng)用
His 標(biāo)簽蛋白的純化。
蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之間相互作用的研究。
配體-受體之間相互作用的研究。
儲存：4℃保存，可保存 2 年。
操作方法
A. 非變性條件下抽提 His 標(biāo)簽蛋白
1. 樣品準(zhǔn)備
1) 準(zhǔn)備細胞，接種，誘導(dǎo)表達。對于實驗室用的 pET 載體表達系列，在細胞 OD600=0.5-0.8 時，用 1 mM IPTG 誘導(dǎo) 1-3 小時，可以獲得理想的表達效率。收集細胞，置于-70°C或立即進行步驟 2 操作。
2) 加入 1/20 細胞生長體積的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意：PMSF 見水分解，需要在使用前加入。
3) 將細胞懸浮起來，超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置 15 分鐘。
5) 13,000 轉(zhuǎn)/分(20,000xg 以上)，4°C 離心 15min。取上清，置于冰上備用或-20°C 保存。
2. 層析
1) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 將上清樣品加至 NTA 層析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。
3) 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗滌填料，流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脫填料，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
5) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。
6) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。