預(yù)染發(fā)光Western Marker

描述：

傳統(tǒng)的 Western Blot 試驗(yàn)需要使用預(yù)染蛋白 Marker 來(lái)跟蹤檢測(cè)陽(yáng)性抗原信號(hào)和轉(zhuǎn)膜效率，但預(yù)染蛋白 Marker 無(wú)法在膠片上曝光，曝光信號(hào)需要根據(jù)膜上的預(yù)染蛋白 Marker來(lái)判斷。全新研發(fā)的Prestained & Western Blot Marker是專門為 Western Blot 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分子量標(biāo)準(zhǔn)，由 9 種發(fā)光蛋白和 9 種預(yù)染蛋白組成；9 中發(fā)光蛋白分別為 23、30、36、44、50、62、90、120 和 160KDa，這些蛋白均可與抗體結(jié)合, 因此能與抗原在同一張膜上曝出信號(hào)，陽(yáng)性信號(hào)可以直接通過(guò) Western Marker 的位置來(lái)判斷；9 種預(yù)染蛋白分別為 15、25、35、40、55、70、100、130 和 180KDa，其中 70KDa為紅色，其他為藍(lán)色，轉(zhuǎn)膜完畢后在膜上肉眼可見(jiàn)。主要特征
可與抗原同時(shí)檢測(cè)信號(hào)，使 Western blot 結(jié)果判斷更加簡(jiǎn)便發(fā)光 marker 沒(méi)有偶聯(lián)和標(biāo)記其他分子，分子量更加準(zhǔn)確綜合發(fā)光 marker 和預(yù)染 marker 的優(yōu)勢(shì)，既能監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜又能與抗原同時(shí)檢測(cè)
儲(chǔ)存：-20°C 保存，有效期 2 年。
使用方法
待 Prestained & Western Blot Marker 至室溫融化后，取 2~10 μl（通常 5μl）至上樣孔中，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳；電泳完畢后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜或 NC 膜，與一抗二抗孵育；孵育完畢后，將本品與抗原一起通過(guò) ECL 曝光至膠片或熒光顯色。
注意事項(xiàng)：
1. 本產(chǎn)品可直接使用，不需要加熱。
2. 可根據(jù)抗體的效價(jià)或曝光時(shí)間的長(zhǎng)短調(diào)整 Prestained & Western Blot Marker 的上樣量。
3. 使用新配制的凝膠，及時(shí)更換電泳緩沖液和轉(zhuǎn)膜液，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。