Strep-Tactin XT Resin

Strep-Tactin XT（Strep-Tactin 的升級產(chǎn)品）瓊脂糖凝膠 FF 是一種將 Strep-Tactin XT 共價(jià)交聯(lián)在瓊脂糖凝膠微球上，形成的生物親和層析分離介質(zhì)。該純化介質(zhì)主要用于純化 Strep tag II 或 Twin strep tag 標(biāo)簽蛋白。Strep tagII 標(biāo)簽為 8 個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽（WSHPQFEK），由于標(biāo)簽小，僅為 1kDa 左右，一般不影響融合后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，常用于融合表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測和純化。由于 Strep-Tacin XT 對 Strep tag II 標(biāo)簽具有高度特異性，一步純化就能獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品。Strep tag II 標(biāo)簽蛋白與凝膠結(jié)合后可使用脫硫生物su競爭方式進(jìn)行洗脫，該洗脫方式比較溫和，對蛋白影響極小。由于 Strep-Tactin 對 Strep tag II 標(biāo)簽具有很強(qiáng)的吸附能力，在生物su的洗脫過程中不易洗脫，造成洗脫效率較低?？梢酝ㄟ^在脫硫生物su洗脫液中添加 25mM NaOH 來提高蛋白回收效率，而添加 NaOH 后會造成 Strep-Tactin從填料上脫落，進(jìn)而污染純化蛋白。本產(chǎn)品為升級的 Strep-Tactin XT，其可耐受高濃度的 NaOH 洗脫（0.5M），除此外 Strep-Tactin XT 可耐受 1%SDS、6M 尿素，因此使用該填料可以在變性條件下純化標(biāo)簽蛋白。
儲存：4~8℃可保存 2 年。
保存液：10mM Tris-HCl，pH7.5；100mM NaCl；20%乙醇
實(shí)驗(yàn)用溶液：
(1) 結(jié)合緩沖液：根據(jù)自身蛋白性質(zhì)來定，一般推薦 50mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl（或采用 PBS）
(2) 洗滌液與結(jié)合緩沖液相同，一般洗滌 5~20 個(gè)柱體積。
(3) 洗脫緩沖液：在結(jié)合緩沖液中加入 2.5~3.5mM D-Biotin?；蚋鶕?jù)蛋白性質(zhì)和用途靈活使用其它洗脫條件，如 2.5mMD-Biotin+10mM NaOH；25~50mM NaOH；0.2% SDS：
(4) 柱再生：0.2M NaOH 洗滌 3~5 個(gè)柱體積；1M NaCl 洗滌 3~5 個(gè)柱體積；PBS 平衡 3~5 個(gè)柱體積。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。