TRIzol Reagent

是一種可提取動(dòng)植物樣品中RNA 的制品。樣品在 TRIzol Reagent 中能夠充分被裂解，在樣品勻漿或裂解過(guò)程中，它可保持 RNA 的完整性，同時(shí)裂解細(xì)胞，溶解細(xì)胞內(nèi)含物。TRIzol Reagent 具有很強(qiáng)的廣譜性，可以適用于各種樣品的總 RNA 提取，提取過(guò)程方便快速，整個(gè)操作在一小時(shí)內(nèi)便可以完成。該試劑可用于小量樣品（50-100 mg 組織、1x106 細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107 細(xì)胞）。對(duì)人、動(dòng)物、植物組織、細(xì)菌均適用，可同時(shí)處理大量不同樣品，整個(gè)提取過(guò)程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。分離的總RNA蛋白質(zhì)和 DNA污染極低，可用于NorthernBlot、反轉(zhuǎn)錄、ployA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和基因克隆。
儲(chǔ)存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
注意：該試劑含有強(qiáng)變性劑，請(qǐng)勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請(qǐng)盡快到醫(yī)院處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)務(wù)必穿實(shí)驗(yàn)服，戴手套。
操作方法
自備試劑：氯仿，異丙醇，70％乙醇（DEPC 水配置），RnaseFree H2O。
Ⅰ 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：RNA 制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及試劑中的 RNA 分解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用 RNA 操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；在操作過(guò)程中避免講話等等。通過(guò)以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
注意事項(xiàng)：
1. 盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前用0.1%DEPC 水溶液在 37℃處理 12h，然后在 120℃高壓滅30min 以除去殘留的 DEPC。
2. 用于 RNA 實(shí)驗(yàn)的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或使用上述方法進(jìn)行 DEPC 水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用 RNA 實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器)，使用的無(wú)菌水須用 0.1%的 DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。
3. RNA 實(shí)驗(yàn)用的試劑和無(wú)菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。