TRIzol Reagent

是一種可提取動植物樣品中RNA 的制品。樣品在 TRIzol Reagent 中能夠充分被裂解，在樣品勻漿或裂解過程中，它可保持 RNA 的完整性，同時裂解細胞，溶解細胞內(nèi)含物。TRIzol Reagent 具有很強的廣譜性，可以適用于各種樣品的總 RNA 提取，提取過程方便快速，整個操作在一小時內(nèi)便可以完成。該試劑可用于小量樣品（50-100 mg 組織、1x106 細胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107 細胞）。對人、動物、植物組織、細菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分離的總RNA蛋白質(zhì)和 DNA污染極低，可用于NorthernBlot、反轉(zhuǎn)錄、ployA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和基因克隆。
儲存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
注意：該試劑含有強變性劑，請勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請盡快到醫(yī)院處理。實驗時務(wù)必穿實驗服，戴手套。
操作方法
自備試劑：氯仿，異丙醇，70％乙醇（DEPC 水配置），RnaseFree H2O。
Ⅰ 實驗前準備：RNA 制備的關(guān)鍵是要抑制細胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及試劑中的 RNA 分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用 RNA 操作專用實驗臺；在操作過程中避免講話等等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
注意事項：
1. 盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前用0.1%DEPC 水溶液在 37℃處理 12h，然后在 120℃高壓滅30min 以除去殘留的 DEPC。
2. 用于 RNA 實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或使用上述方法進行 DEPC 水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用 RNA 實驗用的一次性塑料容器)，使用的無菌水須用 0.1%的 DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。
3. RNA 實驗用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。