Super ECL Substrate

超敏 ECL 顯色液用于 Western、Northern 和 Southernblot 分子雜交的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，比傳統(tǒng)化學(xué)顯色法靈敏度高，可達(dá) pg 水平。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過氧化物酶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，在暗室中對(duì)X-光片感光，以此檢測(cè)微量蛋白而獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。?；鰪?qiáng)型 ECL 顯色液具有靈敏度高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。
應(yīng)用
在 Western 印跡分析，核酸雜交以及 EMSA 實(shí)驗(yàn)中，HRP標(biāo)記的二抗或探針與靶分子結(jié)合再與底物反應(yīng)產(chǎn)生可見光。
儲(chǔ)存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存。
操作方法（以 Western Blot 為例)
1．按每平方厘米膜面積用 0.1-0.2 ml 配置顯色液：根據(jù)顯色液的需要量，取等體積 A 液和 B 液，混勻后避光保存?zhèn)溆?；該顯色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2．2. 取出膜，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的顯色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 顯色液），溶液向四周迅速擴(kuò)散，覆蓋所有膜面。室溫保溫 5 分鐘左右，在此過程中請(qǐng)仔細(xì)觀察信號(hào)的出現(xiàn)。注意：如果信號(hào)強(qiáng)，在暗室中能很快看到陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。
3．3. 待信號(hào)出現(xiàn)且穩(wěn)定后，用鑷子夾起膜，除去多余的顯色液，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在轉(zhuǎn)移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜，除去保鮮膜與轉(zhuǎn)移膜之間的空氣泡，請(qǐng)務(wù)必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染。
4．4. 在暗室中，將膜的正面對(duì)著 X-光片，放入暗盒。次曝光時(shí)間在 1 分鐘左右(有經(jīng)驗(yàn)的操作者可以根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱自行決定)，立即按要求對(duì) X-光片進(jìn)行顯影和定影，確定曝光時(shí)間。曝光時(shí)間從數(shù)秒到數(shù)小時(shí)不等；特別弱的過夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜較硝酸纖維膜能更好的結(jié)合蛋白，因此呈現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)。選高質(zhì)量的 PVDF 膜；盡可能不用 Nylon 膜。
2.2.與抗體結(jié)合以后，要保證膜處于濕潤(rùn)狀態(tài)，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。
3.3.沒有信號(hào)的原因：有些抗體不識(shí)別變性抗原，有時(shí)需要考慮電泳過程對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響；樣品中無(wú)待測(cè)蛋白質(zhì)或含量過低；一抗效價(jià)低，用量少，可適當(dāng)增加一抗的用量；
4.4.背景過高原因：轉(zhuǎn)移膜封閉不充分；與抗體孵育后洗滌；膜在處理過程中過干；二抗用量過多等。
5.5.注意及時(shí)更換顯影液、定影液。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。