SUMO 蛋白酶

也稱(chēng)為 UIP 蛋白酶（分子量 26kD），是一種具有較高活性的半胱氨蛋白酶。SUMO 蛋白酶以一種非常特異的方式切割蛋白，它特異性識(shí)別 UBL 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)－SUMO，而不是氨基酸序列，故該蛋白酶可以切割重組融合蛋白的 SUMO。切割的溫度為 30°C，該酶作用溫度和 PH 范圍（pH7-9）都比較廣泛。酶切后，可通過(guò)Ni-NTA Resin 親和純化很容易地將 SUMO 去除。該 SUMO蛋白酶是自 E.coli 表達(dá)經(jīng)親和純化的重組蛋白酶，含有 His標(biāo)簽。

活性定義：在 1XSUMO Protease Buffer (50 mM Tris-HCl,pH 8.0, 0.2% Igepal, 1 mM DTT)中，30°C 反應(yīng) 1h，剪切>85％的 100pmol 底物，所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位。
儲(chǔ)存：SUMO 蛋白酶置于-20°C 可保存 2 年。

2. 混勻上述體系后于 30°C 孵育 1-16 小時(shí)。若蛋白為熱不穩(wěn)定性，請(qǐng)?jiān)?4°C 孵育較長(zhǎng)時(shí)間或增加酶用量。
3. 取樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。
注意事項(xiàng)
為達(dá)到好的酶切效果，請(qǐng)保證重組蛋白為部分純化的蛋白。對(duì)于大部分融合蛋白，SUMO 蛋白酶所需 NaCl 的濃度不同的蛋白情況會(huì)有所差別，可根據(jù)實(shí)際情況在0～300mM 之間調(diào)節(jié) NaCl 的濃度以達(dá)到的效果。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。