BCA Protein Assay Kit

描述：BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒是根 據(jù)目前世界上常用的蛋白濃度檢測(cè)方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，該試劑盒具有蛋白 濃度測(cè)定的簡(jiǎn)單性，高穩(wěn)定性，高靈敏度和高兼容性。本試 劑盒的原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與 Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，將 Cu2+還原成 Cu+，而 BCA 試劑可 敏感特異地與 Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并在 562nm 處有最大光吸收值，該復(fù)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度 成正比，可根據(jù)吸收值的大小來(lái)測(cè)定蛋白的含量，1 小時(shí)內(nèi) 即可完成蛋白定量檢測(cè)。本試劑盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定范圍為 25～2000 μg/ml。該 試劑盒可用于 20 次試管檢測(cè)或 200 次 ELISA 板檢測(cè)。

操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：按下表將 BSA 進(jìn)行稀釋。
管號(hào) PBS
BSA 體積
（來(lái)源）
BSA 終濃度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根據(jù)樣品數(shù)量及測(cè)定方法，將 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按體積比 50:1充分混勻即可。
注意：配制 BCA 工作液前請(qǐng)將 BCA Reagent A 混勻。
3. 標(biāo)準(zhǔn)比色杯測(cè)定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品置于合適的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)紫外分光光度計(jì)于 562 nm 處檢測(cè)吸光度。
(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
4. 微管測(cè)定方法
(1)分別取 25 μl 新鮮配制的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品，加入到 ELISA 反應(yīng)板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)酶標(biāo)儀于 562nm 處檢測(cè)吸光度。
(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
注意事項(xiàng)
1. 待測(cè)樣品濃度在 25~2000 μg/ml 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2. BCA 工作液配制后 24 小時(shí)內(nèi)使用效果穩(wěn)定。
3. BCA 法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，吸光度會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
4. 使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)，需根據(jù)比色皿的最小檢測(cè)體積，適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小檢測(cè)體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量可相應(yīng)按比例調(diào)整。
5. 適用范圍

實(shí)例操作 按上述操作方法可得到如下標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，該線性方程經(jīng)過 多次繪制，系數(shù)均為 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之間， 重復(fù)性好，在計(jì)算蛋白濃度時(shí)可直接用該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行 計(jì)算。例如：在 562 nm 處檢測(cè)吸光值為 0.1，則此時(shí) y 值 為 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白濃度為 1000 μg/ml。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。