全血microRNA提取試劑盒

描述：生產(chǎn)的全血 miRNA 提取試劑盒是目前世界上提 取小 RNA（<200nt）操作步驟重復(fù)性、小 RNA 產(chǎn)率的方法。使用該試劑盒提取的小 RNA（Small RNA） 中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95%以上，基本不含 有大 RNA 和 DNA。使用該試劑通過一步上柱即可獲得高純 度 miRNA，可在 45min 內(nèi)完成小 RNA 的提取。該試劑盒適 用于凍存和新鮮的抗凝全血樣本（注意該試劑盒不適用于血 清和血漿）。

儲存：室溫可保存 2 年。
使用防護(hù)建議：miRNA Reagent A 溶液中含有胍鹽，其具有強烈的腐蝕性，試驗時請務(wù)必佩戴防護(hù)眼鏡、手套、口罩等防護(hù)措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。
自備試劑：異丙醇、乙醇、75%異丙醇
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。將150μl 抗凝全血加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震蕩混合均勻。室溫靜置 5min 以充分裂解細(xì)胞。
(2) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 250μl miRNA ReagentB，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的 1.5ml EP 管中。
(3) 向上述溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置 5min。
(5) 13,000rpm 離心 10min，轉(zhuǎn)移 700μl 上清液到新的 1.5mlEP 管中。
(6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。
(7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm離心 1min，倒掉過濾液。
(8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm離心 1min，倒掉過濾液。
(9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm離心 1min，倒掉過濾液。
(10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。
(11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TEBuffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產(chǎn)物即為提取的 miRNA。。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。