血清血漿microRNA提取試劑盒

描述：血清血漿 miRNA 提取試劑盒是目前提取小 RNA（<200nt）操作步驟簡單、重復(fù)性、小 RNA 產(chǎn) 率的方法之一。使用該試劑盒通過一步上柱即可獲得高 純度 miRNA，可在 10min 左右完成小 RNA 的提?。磺沂褂?該試劑盒提取的小 RNA（Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA，可 直接用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、Northern 雜交、測序等應(yīng)用。

儲(chǔ)存：室溫可保存 2 年。
使用防護(hù)建議：Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍鹽，其具有強(qiáng)烈的腐蝕性，試驗(yàn)時(shí)請務(wù)必佩戴防護(hù)眼鏡、手套、口罩等防護(hù)措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。
自備試劑：異丙醇、乙醇、75%異丙醇、2ml EP 管
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。將 300μl 血清或血漿樣本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中，用腕力混勻 30s,室溫放置 5min。
(2) 13,000rpm 離心5min，將上清約 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 異丙醇，上下顛倒混合均勻。
(3) 將上述溶液分三次加至吸附柱中（每次約 700μl），13,000rpm 離心 15s，倒掉過柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。
(7) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree H2O，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產(chǎn)物即為提取的 miRNA。
常見問題匯總：
(1) 由于血清血漿中的 miRNA 含量極低，提取的 miRNA 濃度通常在 5 ng/μl 以下，因此難以用常規(guī)的 NanoDrop 測量濃度，建議直接使用 10 μl 進(jìn)行下游反轉(zhuǎn)錄。由于本試劑盒提取的是小 RNA，該濃度下的 miRNA Copy 數(shù)足以進(jìn)行下游檢測。
(2) 由于血清血漿中 miRNA 的含量低，為了獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議使用特異性和靈敏度更好的 TaqMan 探針法進(jìn)行 miRNA 的下游檢測。本試劑盒提取的 miRNA 并不限于其它檢測方法和用途，包括 SYBR Green 法檢測、二代測序、芯片等檢測領(lǐng)域。
(3) 血清血漿 TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為血清血漿專用，不可用于細(xì)胞和組織的 miRNA 檢測實(shí)驗(yàn)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。