血清血漿TaqMan miRNA反轉錄試劑盒

血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒采用加 A 法進行反轉錄，加 A 法的反轉錄效率遠高于莖環(huán)法，因此，采用該方法可極大的提高檢測靈敏度（原理見圖 1）。該試劑盒操作簡單，僅需要兩步即可輕松完成miRNA 的 cDNA 合成，合成的 cDNA 可用于所有 miRNA的后續(xù)定量檢測。反轉錄完畢后采用特異性的上游引物和接頭引物進行 PCR 擴增，F(xiàn)AM 標記 TaqMan 探針作為熒光報告基團進行定量檢測（原理見圖 1）。 的血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒專用于血清血漿 miRNAs 分子的反轉錄試驗（不可用于組織和細胞），轉錄獲得的 cDNA 產物用于 TaqMan 定量 PCR 方法檢測 miRNAs 分子（僅適用 TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒，。

儲存：請置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融
操作方法
1 按以下組分在 0.2 ml EP 管中配制應液血清血漿 miRNA 10 μl5×TaqMan miRNA RT Solution A 2.5 μl
2 在 PCR 儀上按以下條件進行加 A 反應:37°C 30min　85°C 5min
3 反應完畢后，在上述 12.5μl 反應體系中加入如下試劑，并混合均勻。
10×PS TaqMan miRNA RT Primer 2.5 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2.5 μl
H2O 7.5 μl
4 在 PCR 儀上按以下條件進行反轉錄反應30°C 5min　55°C 60mi　95°C 5min獲得的 cDNA 產物可用于多個目標 miRNA 的檢測。通常取2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒檢測該試劑盒有一萬余種，詳細列表可查詢HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls)。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。