一步法miRNA反轉錄試劑盒

描述：由于 miRNAs 分子序列較小，僅 20nt 左右，沒有 真核生物有的 Poly(A)尾巴結構，采用傳統(tǒng) Oligo dT 引 物和隨機引物很難獲得從 miRNA 到 cDNA 的反轉錄產(chǎn) 物。 公司開發(fā)出一套全新的加 A 法 miRNA 反轉 錄試劑盒，基于 Peter 改良的 miR-Q 技術， 可以對成熟的 miRNA 同時完成加 A 反應和反轉錄反應， 直接獲得含有特異性 tag 和 15(T)的 cDNA 產(chǎn)物（如圖 1 所示）。該方法使得 miRNA 反轉錄與 mRNA 的反轉錄一 樣輕松。直接將提取的 miRNA 與反應緩沖液混合物混合， 并置于 PCR 儀上 1 小時即可獲得高濃度的、包含所有 miRNAs 分子的 cDNA 產(chǎn)物。獲得的 cDNA 產(chǎn)物適用于 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行定量檢測，該方法 已被大量文獻所采用。 

儲存：請置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融
操作方法
1. 按以下組分配制反轉錄反應液
miRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg
4×One step miRNA RT Solution 5 μl
*10×miRNA RT Primer 2 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*特別說明： 10×miRNA RT Primer 引物為
5’-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，定量擴增
用特異性上下游引物進行擴增，圖 2 是以 hsa-miR-21 為
實例說明特異性上下游引物的設計方法
2. 在 PCR 儀上按以下條件進行反應:
 37°C 60min
 95°C 5min
3. 獲得 cDNA 產(chǎn)物后使用 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行 miRNA 定量檢測。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。